CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為新一代基因編輯工具,，因其構(gòu)建方便,、設(shè)計(jì)靈活,，操作簡(jiǎn)單,、效率高成本低，成為基因敲除的新一代利器,。該系統(tǒng)由有DNA切割活性Cas9蛋白和識(shí)別特異靶點(diǎn)的sgRNA組成,。Cas9是一種核酸內(nèi)切酶，它和sgRNA構(gòu)成的復(fù)合體能與DNA分子上的特定序列結(jié)合,，并在PAM序列(幾乎存在于所有基因)上游切斷DNA雙鏈,。DNA被切斷后，細(xì)胞會(huì)啟動(dòng)DNA損傷修復(fù)機(jī)制,，造成基因的缺失,、移碼、插入等隨機(jī)突變模式,，達(dá)到修復(fù)雙鏈斷裂的目的,，同時(shí)造成靶向基因敲除。
CRISPR/Cas9：穩(wěn)定細(xì)胞系構(gòu)建服務(wù)流程
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內(nèi)容 |
詳細(xì)信息 |
服務(wù)周期 |
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gRNA 設(shè)計(jì)合成及載體構(gòu)建 |
gRNA 設(shè)計(jì)及合成 ,、載體構(gòu)建,、質(zhì)粒測(cè)序及制備 |
2-3 周 |
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轉(zhuǎn)染 |
慢病毒侵染 |
2-3 周 |
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單克隆細(xì)胞制備 |
單克隆細(xì)胞稀釋培養(yǎng)、篩選,、PCR鑒定,、獲得基因敲除單克隆細(xì)胞株 |
5-8 周 |
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鑒定 |
測(cè)序鑒定 |
2-3 周 |
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送貨 |
提供項(xiàng)目COA、穩(wěn)定克隆 |
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案例展示：
1．構(gòu)建慢病毒載體的crispr sgRNA的單質(zhì)粒系統(tǒng),。
2．經(jīng)過293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染,，包裝得到慢病毒。
3．通過慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的方式感染目的細(xì)胞,。
4．通過抗生素篩選和單克隆挑取后,，擴(kuò)大培養(yǎng)。
5．經(jīng)挑取單克隆細(xì)胞后,，提取得到單克隆細(xì)胞的基因組DNA，再通過PCR擴(kuò)增目的基因編輯位點(diǎn)的上下游區(qū)段,，經(jīng)過TA克隆連接到PMD19T的載體上,，進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，選取10個(gè)菌落測(cè)序鑒定得到單克隆的細(xì)胞是否單一,。
下圖是交付給客戶的單克隆細(xì)胞驗(yàn)證結(jié)果：
T7E1酶切法突變體檢測(cè)試驗(yàn)檢測(cè)CRISPR/Cas9的編輯效率：
賽爾瑞成采用T7E1酶切法突變體檢測(cè)試驗(yàn)檢測(cè)CRISPR/Cas9的編輯效率,。若sgRNA有效編輯了基因組DNA，則目的基因在修復(fù)后會(huì)出現(xiàn)堿基缺失突變現(xiàn)象,，通過分析T7E1酶處理目標(biāo)DNA片段的雜合鏈后的情況,，從而驗(yàn)證Cas/sgRNA的編輯效率，用于篩選編輯效率高的sgRNA,。
