親和層析是利用生物分子間專一的親和力而進行分離的一種層析技術,。抗體與抗原,、激素與受體,、酶與底物等這些生物大分子之間因存在這種特異性親和力，常常一種分子作為配基,，制備成親和層析介質,，用來純化對應的目標分子，這種方法稱為親和層析法,。具體來講,，親和層析法即是將配基固定于惰性載體上，混合物中的目標蛋白與配基特異性結合,，從而被捕獲,，無關的雜質組分隨著流動相被沖洗下來，然后選擇合適的洗脫液講目標蛋白從載體上洗脫下來,，從而得到單一組分的純化物質,。
抗體親和層析
蛋白A、蛋白G和蛋白L是科學家陸續(xù)發(fā)現(xiàn)能夠與抗體進行特異性結合的蛋白分子,。
圖1. 抗體親和層析示意圖
目前蛋白A及其衍生的重組蛋白,、蛋白G已廣泛應用于抗體的純化。隨著我國抗體藥物和免疫診斷產業(yè)的快速發(fā)展，抗體制備量將大幅提升,，市場對蛋白 G,、蛋白 A 的需求量會迅速增加。
蛋白A
蛋白A是一種來源于金黃色葡萄球菌的細胞壁表面蛋白,，能夠與免疫球蛋白特異性結合,，廣泛用于抗體的檢測和純化。
天然蛋白A結構穩(wěn)定,，不耐酸堿,，分子內部不存在二硫鍵，擁有5個高度同源的區(qū)域,，與IgG有結合作用,。在SPA的5個結構域中，每個結構域都由58個氨基酸組成三個α反向螺旋,，三維結構穩(wěn)定,。蛋白A與多種來源的IgG都有很強的親和力，結合位點位于IgG的Fc段,，不影響IgG結合抗原的活性,。目前，以蛋白A為親和配基的親和層析介質已廣泛應用于單克隆抗體和Fc重組融合蛋白的純化,。
由于層析柱在使用時,，因樣品中變性的蛋白、脂類,、DNA等物質常殘留在層析介質中,，嚴重影響了層析介質的使用壽命，常采用0.1-0.5M的氫氧化鈉進行清洗,，而天然或普通的重組蛋白A對氫氧化鈉并不耐受,，往往導致蛋白A的變性和脫落。
賽爾瑞成通過基因重組改造,，開發(fā)的耐堿蛋白A擁有四個IgG功能結合域,，末端帶有巰基，具有高耐堿性,、高親和力的特點,，可作為配基制備成耐堿蛋白A親和層析介質。
圖2. 耐堿蛋白A 經SDS-PAGE檢測純度>95%
表1.耐堿蛋白A親和層析介質耐堿性能測試
蛋白A對免疫球蛋白IgG亞型的結合是有選擇性的,，例如在人IgG 的四種亞型IgG1,、IgG2、IgG3和IgG4中,，蛋白A唯獨不與IgG3結合。在與IgA結合中，只與IgA2結合,，不結合IgA1,。蛋白A不結合禽類血清IgG。
蛋白G
1973 年,，瑞典的科學家 Kronvall 研究發(fā)現(xiàn),，鏈球菌細胞壁表面存在能與 IgG 結合的蛋白，但是并不與 Ig A,、Ig M,、IgD 和 IgE 有類似的結合反應。1984 年,，Bjorck等將這類蛋白統(tǒng)稱為鏈球菌蛋白 G,。
蛋白G是一種源自鏈球菌G族的細胞壁蛋白，分子量25kDa,，為三型Fc受體,。蛋白G可以與IgG的Fc 區(qū)域特異性結合，與蛋白A相比對IgG具有更好的結合能力,，血清蛋白結合水平更低,，純度更高，配基脫落也相對更低,。天然的蛋白 G不僅與免疫球蛋白的恒定區(qū)相結合,且與白蛋白,、α2-巨球蛋白相結合，這使得用蛋白G親和色譜提純抗體,，無法除去體系中存在的白蛋白和巨球蛋白,。
蛋白G的免疫球蛋白結合區(qū)域主要與IgG的 Fc片段作用，該區(qū)域含有C1,、C2,、C3 三個由 55 個氨基酸組成的單結構域，分別被16個氨基酸組成的間隔區(qū)域 D1,、D2分隔開,，每一個單結構域都能夠與抗體IgG的Fc片段結合。
圖3. 鏈球菌蛋白G的結構
賽爾瑞成開發(fā)的重組蛋白G含有三個與Fc結合的結構域,，已經除去了與白蛋白及細胞表面結合位點,，減少了交叉反應和非特異性結合。
圖4. 蛋白G經SDS-PAGE檢測純度>95%
表2.蛋白G偶聯(lián)柱料抗體載量
重組蛋白G具有廣泛的結合譜,，可與人,、牛、兔,、山羊,、大鼠和小鼠的多克隆抗體結合，并且可結合小鼠 IgG1、IgG2a 和 IgG3 還有大鼠 IgG2a,、IgG2b 和 IgG2c等單克隆抗體,。重組蛋白G幾乎可與所有哺乳動物IgG結合，只是親和力強弱有所不同,。
蛋白L
蛋白L是從馬格努斯消化鏈球菌分離出來的能和免疫球蛋白特異性結合的蛋白質,，分子量36 kD。與蛋白A和蛋白G結合到（抗體）的Fc區(qū)不同的是,，蛋白L能夠結合那些含有κ輕鏈的抗體,，結合位點位于蛋白L N端的五個小的同源結構域。這些結構域的三維結構與蛋白質G結構域非常相似,，盡管蛋白質G和L沒有顯著的序列同源性,。
蛋白L能夠結合IgG、IgM,、IgA,、IgE和IgD，還可以結合單鏈抗體ScFv和Fab,。與蛋白A和蛋白G相比,，蛋白L更能廣泛地結合各種來源及亞類的抗體，包括人,、小鼠,、大鼠、兔和雞,，但不結合牛,、山羊或綿羊來源的免疫球蛋白。
賽爾瑞成開發(fā)的重組蛋白L,，既保留了與抗體κ鏈結合的特性,，同時也不會影響抗體的抗原結合位點。
附表：Protein A,、Protein G,、Protein L結合抗體能力比較
注：+: 表示結合能力, + 越多, 結合能力越強; -: 表示不結合; N/A: 無數(shù)據(jù)
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