◆ 細胞培養(yǎng)通風(fēng)櫥（即生物安全柜）
◆ 培養(yǎng)箱（通用推薦：濕式二氧化碳培養(yǎng)箱）
◆ 離心機
◆ 醫(yī)用冰箱（4℃）和冰柜（-20℃）,、生物超低溫冰箱（-80℃）、液氮冷凍罐
◆ 倒置顯微鏡
◆ 無菌工作區(qū)域：細胞培養(yǎng)實驗室的主要要求是需要維持細胞培養(yǎng)操作工作區(qū)域處于無菌狀態(tài)，最簡單經(jīng)濟的方式就是使用細胞培養(yǎng)通風(fēng)櫥,。
◆ 無菌試劑和培養(yǎng)基：商品化試劑和培養(yǎng)基經(jīng)過嚴格的質(zhì)量控制以確保無菌,，注意操作過程中不要被污染，其他試劑和溶液需要選擇適當?shù)臏缇椒ǎɡ纾焊邏赫羝?、無菌過濾等）進行滅菌,。
◆ 無菌操作：要求操作人員在實驗開始前對工作區(qū)域和雙手操作部分進行75%酒精消毒；盡量使用一次性塑料吸管進行單次操作,，避免交叉污染,；試劑瓶和培養(yǎng)用具使用時方可開蓋，用后要第一時間蓋上,，暴露于環(huán)境中的時間盡可能要短,。
◆ 整體的細胞實驗環(huán)境也彌足重要，需要定期對實驗室環(huán)境進行較為徹底的清掃消毒和殺菌,，包括實驗用儀器和室內(nèi)地面,、桌面等,。
1. 在細胞狀態(tài)不足以滿足實驗需求或者出現(xiàn)細胞污染的情況下,，需要進行細胞復(fù)蘇：
2. 從超低溫冰箱或者液氮中取出自保存或商品化購買的凍存細胞后,，快速轉(zhuǎn)移至37℃水浴條件下輕輕轉(zhuǎn)動融化（一分鐘內(nèi)）。
3. 75%酒精擦拭凍存管外部后,，轉(zhuǎn)移至通風(fēng)櫥中,。
4. 加入適量新鮮的完全培養(yǎng)基混合，約800-1000rpm下離心5-10分鐘,，實際離心速度時間取決于細胞種類和細胞狀態(tài),。
5. 新鮮培養(yǎng)基重懸后接種于相應(yīng)的培養(yǎng)器皿中，做好標記,，37℃,，5%CO2條件下培養(yǎng)。
1. 為現(xiàn)有細胞系做細胞儲備,，需要對代數(shù)相對靠前的細胞進行擴增培養(yǎng)和細胞凍存：
2. 準備細胞凍存液，置于2℃-8℃下備用,。
觀察待凍存的細胞,，密度達到80%-90%左右，將貼壁/懸浮細胞分別按照傳代方法收集,。
3. 使用血球計數(shù)板對細胞密度進行大致估算后,，計算出凍存溶液的體積，從而保證單支凍存細胞有足夠的細胞量用于復(fù)蘇,。
4. 約800-1000rpm下離心5-10分鐘,，無菌條件下小心棄去培養(yǎng)基，不要攪動細胞沉淀,。
5. 用合適體積的預(yù)冷后凍存液重新混懸細胞沉淀,，分裝至凍存管中，做好標記后進行梯度降溫至液氮環(huán)境中保存,，入庫,。
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通用細胞凍存液 |
Cellregen 無血清細胞凍存液 |
無血清低 DMSO 細胞凍存液 |
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主要成份 |
含血清、含 DMSO |
不含血清,，含 DMSO 10% |
不含血清,，低 DMSO 5% |
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細胞毒性 |
高 |
高 |
低 |
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安全性 |
低 動物來源病毒、霉菌和支原體等污染的風(fēng)險偏高 |
高 無動物來源病毒,、霉菌和支原體等污染的風(fēng)險 |
高 無動物來源病毒,、霉菌和支原體等污染的風(fēng)險 |
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凍存細胞種類 |
適合含血清細胞凍存 |
通用型 適合各類細胞凍存 |
通用型 適合各類細胞凍存 |
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無血清培養(yǎng)細胞生長狀態(tài) |
易改變易由懸浮狀態(tài)回復(fù)貼壁狀態(tài) |
保持懸浮培養(yǎng)狀態(tài) |
保持懸浮培養(yǎng)狀態(tài) |
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批次差異 |
批次差異大 |
無批次差異 |
無批次差異 |
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操作方法 |
步驟繁瑣 需程序降溫凍存 |
簡單快捷 一步凍存 -80 ℃冰箱 |
簡單快捷 一步凍存 -80 ℃冰箱 |
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保存設(shè)備 |
要求高（液氮） |
要求低（ -80℃ 冰箱） |
要求低（ -80℃ 冰箱） |
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微量凍存 |
細胞易死亡，存活率偏低 |
細胞存活率高 |
細胞存活率高 |
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原位凍存 |
不可行 |
可行,，且方便快捷 如 : 雜交瘤細胞孔板凍存 |
可行,，且方便快捷 如 : 雜交瘤細胞孔板凍存 |
◆ 細胞的復(fù)蘇中，如細胞對溫度比較敏感,，可將生長培養(yǎng)基預(yù)熱至37℃后再加入融化后的細胞凍存液中混勻,。
◆ 將復(fù)蘇的細胞高密度接種，如兩支凍存細胞接種到一個孔板中,，可有效提高復(fù)蘇效率,。
◆ 細胞凍存，在加入凍存液進行分裝的過程中,，要不時輕輕混合細胞,，使其保持均勻的細胞懸液狀態(tài)，更有利于保證細胞的凍存效果,。
1. 當培養(yǎng)貼壁細胞密度達到80%左右即可細胞的傳代操作，從培養(yǎng)器皿中吸棄原有的細胞生長培養(yǎng)基,。
2. 使用不含鈣鎂離子的平衡鹽溶液輕輕潤洗細胞（緩沖液用量根據(jù)培養(yǎng)器皿的表面積調(diào)整）,，避免攪動細胞，前后輕晃動器皿數(shù)次,。
3. 吸棄緩沖液,，重復(fù)潤洗一次。
4. 向培養(yǎng)器皿中加入適量的預(yù)熱解離劑（如胰蛋白酶等）,，充分覆蓋細胞層,，輕輕晃動容器數(shù)次。
5. 將培養(yǎng)器皿在室溫下孵育2-5分鐘,。實際孵育時間實際根據(jù)細胞系的種類不同而定,。6. 移至倒置顯微鏡下觀察細胞解離情況,，可輕輕拍打器皿壁沿以加快細胞解離。
7. 當細胞解離程度大于90%,，加入三倍于解離液體積的生長培養(yǎng)基中止解離過程,，輕輕晃動后吹打細胞，收集至無菌離心管中,。
8. 約800-1000rpm下離心5-10min,，實際離心速度時間取決于細胞種類和細胞狀態(tài)。
9. 棄去含解離劑的上清溶液,，用最少體積的生長培養(yǎng)基重懸細胞沉淀,，混勻后取出少量使用血球計數(shù)板計算細胞數(shù)量。
10. 將細胞懸液稀釋到該細胞系推薦的接種密度,，并將適量體積的細胞懸液轉(zhuǎn)移至新的細胞培養(yǎng)器皿中放回培養(yǎng)箱,。
1. 當細胞生長至適合傳代（即處于對數(shù)生長期而未達到聚合的狀態(tài)）時，從培養(yǎng)瓶中吸取出少量的細胞樣品,，如有細胞已部分沉淀,，要先輕輕晃動培養(yǎng)瓶使細胞處于均勻的懸浮狀態(tài)后再取樣。
2. 使用血球計數(shù)板對細胞進行計數(shù),。
3. 計算將細胞稀釋到推薦接種密度所需要的加入的培養(yǎng)基體積,，如有必要，可先對培養(yǎng)瓶中細胞進行離心收集（800-1000rpm,、5-10min）后再重懸計數(shù)和接種,。
4. 在無菌狀態(tài)下將適量預(yù)熱的生長培養(yǎng)基加入培養(yǎng)瓶中,，必要時可將培養(yǎng)的細胞分散接種到多個培養(yǎng)瓶中,。
5. 將培養(yǎng)瓶的旋蓋外旋一圈，便于進行充分的氣體交換（或者使用透氣性瓶蓋）,，并將培養(yǎng)瓶放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),。
◆ 貼壁細胞在進行解離（消化）過程中，如果室溫下效果不理想,，可轉(zhuǎn)移至37℃培養(yǎng)箱中加快該過程,，但要注意控制時間，每30秒需要鏡檢一次,。
◆ 細胞在緩沖液潤洗過程中要盡量完全徹底,，培養(yǎng)液中的血清殘留會影響消化效果。
◆ 為了減少細胞碎片和無用的代謝副產(chǎn)物在培養(yǎng)液中累積,，每三周或者必要時都應(yīng)將懸浮細胞收集起來進行一次離心重懸再接種,，具體操作等同于正常的傳代培養(yǎng)。
◆ 通常情況下,，懸浮細胞培養(yǎng)中所需添加特定的生長依賴因子,，盡量按照“現(xiàn)用現(xiàn)添加”的原則,，從而保證培養(yǎng)基中該物質(zhì)的濃度足夠滿足細胞的生長需求。
